Stage « Tous chercheurs » 2014

L’association « Tous chercheurs » recevait du 23 au 25 avril 2014, dans un laboratoire de l’Inserm sur le campus de Lumigny à Marseille, 11 personnes de l’AFH pour un stage de sensibilisation au travail des chercheurs. L’objectif de Marion Mathieu, chercheur à l’Inserm qui animait ce stage, était de faire découvrir les fondements des expériences conduites dans les laboratoires de recherche.

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Premier jour : Familiarisation avec les éléments de base du vivant.

La cellule est l’unité de base qui compose les êtres vivants. Un homme est constitué de 10 000 milliards de cellules (cellules de peau, du cerveau, des os…) Chaque cellule est semblable à une usine et fabrique les protéines qui sont nécessaires à l’organisme (par exemple : protéines nécessaires à la digestion, pigments pour la couleur des yeux…). Pour fabriquer ces protéines, nous avons découvert que toutes les cellules contiennent dans leur noyau un « livre de recettes » identique. Mais en fonction de leurs spécialisations, chaque type de cellule prépare une « recette » plutôt qu’une autre. Les cellules de la peau fabriquent de la mélanine, les globules rouges ont plutôt besoin d’hémoglobine, le foie fabrique entre autres les facteurs VIII et IX pour la coagulation. Ces recettes sont appelées les gènes. Ces gènes sont stockés sur un long fil d’ADN (2 mètres d’ADN dans chaque cellule). Chez l’homme, cet ADN est compacté dans 23 paires de chromosomes afin de tenir dans le minuscule noyau des cellules.

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Nous avons prélevé des cellules de notre bouche sur un coton tige, frotté ce coton tige sur une lame de verre (pour y déposer les cellules prélevées) et ajouté une goutte de bleu de méthylène (colorant spécifique de l’ADN) sur la lame. Nous avons pu ainsi observer au microscope la structure de ces cellules (photo de gauche).

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Expérience qui peut être réalisée à la maison

Pour visualiser l’ADN des cellules, nous avons prélevé de la salive dans un tube (1 cm), nous y avons ajouté un peu de sel et du savon vaisselle pour dissoudre la membrane des cellules. Puis, nous avons versé doucement de l’alcool (pas d’alcool à bruler) dans le tube et l’ADN des cellules est remonté vers la surface du tube. C’est le nuage blanchâtre que l’on voit en suspension (photo de droite).

Deuxième jour : Sélection et copie d’un gène

L’ADN est composé de 4 « briques », appelées nucléosides, qui se répètent pour composer la séquence de chaque gène. L’ADN peut être comparé à une encyclopédie organisée en plusieurs volumes (les 23 paires de chromosomes) contenant des recettes (les gènes) écrites avec un alphabet très simple (les nucléotides). L’ADN de chaque individu comprend un chromosome reçu de sa mère et un de son père d’où 23 paires de chromosomes. Dans une paire de chromosomes, ce sont donc les mêmes gènes qui sont répétés. Les chercheurs savent lire l’ADN et trouver le début et la fin d’un gène donné.
Pour le deuxième jour, nous avions comme objectif de copier un de nos gènes, situé sur le chromosome 8, connu pour n’avoir que 2 formes dans la population humaine : 100 ou 400 nucléotides. Nous utilisons toujours des cellules de notre bouche que nous mettons dans un tube avec différents produits chimiques (chlorure de sodium puis résine de Chelex) pour faire éclater les membranes cellulaires et ouvrir les noyaux.

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Nous chauffons ce tube puis le faisons tourner dans un appareil à très haute vitesse (centrifugation), les éléments les plus lourds (membranes, protéines) sont plaqués au fond et l’ADN surnage dans le liquide (photo de droite).
L’ADN ainsi récupéré est mis dans un nouveau tube avec des nucléotides, une enzyme capable de copier l’ADN (ADN polymérase) et des amorces (petits segments d’ADN capables de reconnaître le début du gène que l’on veut copier). Pour observer le gène qui nous intéresse, il faut le copier en très grande quantité et ainsi le différencier des autres gènes ou morceaux d’ADN présents dans le tube.

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Cette technique, très utilisée dans les laboratoires, est appelée PCR (Polymerase Chain Reaction – réaction de polymérisation en chaine). Après 3 heures de PCR, nous avons l’ADN introduit dans le tube au départ et une très grande quantité de copies du gène du chromosome 8 que nous souhaitons observer. (Photo de gauche machine à PCR)
Il nous faut donc premièrement les trier. Nous disposons le liquide sur un gel spécial dans lequel les brins d’ADN vont se déplacer en fonction de leur taille (plus ils sont longs, plus ils sont lourds et donc moins ils se déplacent vite dans ce gel).

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Ensuite, ce gel est observé grâce aux ultra-violets (photo de droite). Chaque participant avait déposé un échantillon du tube contenant son ADN dans le haut du gel et les brins d’ADN ont migré vers le bas en fonction de leur taille (100 nucléotides plus bas que 400). Sur le bord gauche nous avons déposé un repère : c’est un liquide formé d’un mélange d’ADN dont les tailles sont connues (ces mélanges sont vendus par des sociétés spécialisées). Chaque colonne suivante correspond à l’échantillon d’un participant. Pour les colonnes 1, 3 et 6 on observe un gros trait. Ces personnes n’ont, sur leurs 2 chromosomes, qu’une seule version du gène observé : gène avec 400 nucléotides. Pour les colonnes 2, 4, 5, 7, 8 et 10 une seule version du gène observé : gène avec 100 nucléotides. La colonne 9 présente deux traits à peu près équivalents en intensité ; cette personne possède les 2 formes du gène (100 et 400 nucléotides), l’un provenant de son père, l’autre de sa mère.

Troisième jour : Insertion d’un gène dans une cellule et expression de ce gène sous forme d’une protéine

Les traitements antihémophiliques dits « recombinants » sont fabriqués dans des cellules de mammifères, le plus souvent des cellules d’ovaire de hamsters chinois. Les chercheurs ont copié le gène du Facteur VIII (ou du Facteur IX) et l’ont introduit dans ces cellules. Elles sont ensuite mises dans un milieu de culture (avec les nutriments nécessaires à leur survie). Ces cellules produisent ainsi la protéine du FVIII en plus des protéines qu’elles produisent habituellement. La protéine de FVIII est récupérée du milieu de culture par filtration et purification puis conditionnée par doses de 500, 1000 (…) unités de FVIII.
Pour notre troisième expérience, nous avons introduit un gène dans une bactérie et vérifié que ce gène s’exprimait. L’Escherichia Coli (E. coli) est une bactérie présente dans la flore intestinale des mammifères. Cette cellule ne contient qu’un seul chromosome, mais son fonctionnement général est très semblable à celui des cellules de mammifère. Pour se multiplier, les bactéries se scindent en deux bactéries toutes les 20 minutes. Les bactéries ne peuvent survivre en présence d’antibiotiques.
Nous avons choisi d’introduire, dans ces bactéries, le gène de la GFP (Green Fluorescent Protein - protéine fluorescente verte). Ce gène, présent chez les méduses de mer de chine, permet de fabriquer une protéine qui rend ces méduses fluorescentes. Pour l’expérience ce gène est placé sur un brin d’ADN circulaire avec un gène de résistance à un antibiotique (Kanamycine).

Dans un tube à essais, on met des bactéries, du Chlorure de sodium et des brins d’ADN circulaires. Dans la moitié des tubes, on met de l’eau à la place de ces brins d’ADN, c’est notre contrôle négatif. On soumet les tubes à un choc thermique pour créer des petits trous dans la membrane des bactéries (tout en les gardant en vie). Des brins d’ADN vont ainsi pouvoir entrer dans un certain nombre de bactéries. Pour observer les bactéries aisément, nous déposons en fine couche très peu du mélange contenu dans le tube sur un milieu nutritif solide dans des boites. Sur la moitié des boites, nous avons aussi ajouté de la Kanamycine afin d’éliminer les bactéries qui n’ont pas reçu l’ADN circulaire et de sélectionner celles qui ont incorporé le gène d’intérêt (GFP + résistance à la Kanamycine). Après plusieurs heures en culture, nous obtenons 4 boites de culture d’aspects différents :

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Enfin sur la boite 4 nous avons des colonies de bactéries ; seules celles qui ont le gène de résistance à la Kanamycine (et aussi le gène GFP), donc qui ont reçu l’ADN circulaire se sont multipliées.

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Observées avec une lampe à ultra-violet elles sont fluorescentes : Ces bactéries expriment bien le gène que nous leur avons implanté.

En dernière partie du stage, Olivier Christophe, chercheur à l’INSERM et membre du groupe de travail « Recherche » de l’AFH, nous a présenté les différentes voies de recherche dans le traitement des maladies liées à la coagulation. Des facteurs recombinants à durée de vie prolongée sont actuellement à l’essai, mais les chercheurs tentent par différents procédés d’introduire le gène du FVIII ou du FIX dans les cellules des patients pour aller vers la guérison.

Un grand merci à l’association « Tous chercheurs » pour son investissement à nos côtés et aux 11 membres de l’AFH pour s’être investis pendant ces 3 jours.

Mise en ligne le 18 décembre 2014 par Jean-Michel Alcindor


[1Boite 1 translucide car couverte de bactéries (contrôle négatif)

[2Boite 2 transparente il n’y a plus de bactéries (contrôle négatif).

[3Boite 3 beaucoup de bactéries mais un grand nombre n’ont pas le gène d’intérêt (gène de la GFP).

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